居正為人，頎面秀眉目，須長至腹。勇敢任事，豪杰自許。然沉深有城府，莫能測也。嚴嵩為首輔，忌階，善階者皆避匿。居正自如，嵩亦器居正。遷右中允，領國子司業事。與祭酒高拱善，相期以相業。尋還理坊事，遷侍裕邸講讀。王甚賢之，邸中中官亦無不善居正者。而李芳數從問書義，頗及天下事。尋遷右諭德兼侍讀，進侍講學士，領院事。
階代嵩首輔，傾心委居正。世宗崩，階草遺詔，引與共謀。尋遷禮部右侍郎兼翰林院學士。月余，與裕邸故講官陳以勤俱入閤，而居正為吏部左侍郎兼東閣大學士。尋充《世宗實錄》總裁，進禮部尚書兼武英殿大學士，加少保兼太子太保，去學士五品僅歲余。時徐階以宿老居首輔，與李春芳皆折節禮士。居正最后入，獨引相體，倨見九卿，無所延納。間出一語輒中肯，人以是嚴憚之，重于他相。
高拱以很躁被論去，徐階亦去，春芳為首輔。亡何，趙貞吉入，易視居正。居正與故所善掌司禮者李芳謀，召用拱，俾領吏部，以扼貞吉，而奪春芳政。拱至，益與居正善。春芳尋引去，以勤亦自引，而貞吉、殷士儋皆為所構罷，獨居正與拱在，兩人益相密。拱主封俺答，居正亦贊之，授王崇古等以方略。加柱國、太子太傅。六年滿，加少傅、吏部尚書、建極殿大學士。以遼東戰功，加太子太師。和市成，加少師，余如故。
初，徐階既去，令三子事居正謹。而拱銜階甚，嗾言路追論不已，階諸子多坐罪。居正從容為拱言，拱稍心動。而拱客構居正納階子三萬金，拱以誚居正。居正色變，指天誓，辭甚苦。拱謝不審，兩人交遂離。拱又與居正所善中人馮保郄。穆宗不豫，居正與保密處分后事，引保為內助，而拱欲去保。神宗即位，保以兩宮詔旨逐拱，事具拱傳，居正遂代拱為首輔。帝御平臺，召居正獎諭之，賜金幣及繡蟒斗牛服。自是賜賚無虛日。
帝虛己委居正，居正亦慨然以天下為己任，中外想望豐采。居正勸帝遵守祖宗舊制，不必紛更，至講學、親賢、愛民、節用皆急務。帝稱善。大計廷臣，斥諸不職及附麗拱者。復具詔召群臣廷飭之，百僚皆惕息。帝當尊崇兩宮。故事，皇后與天子生母并稱皇太后，而徽號有別。保欲媚帝生母李貴妃，風居正以并尊。居正不敢違，議尊皇后曰仁圣皇太后，皇貴妃曰慈圣皇太后，兩宮遂無別。慈圣徙乾清宮，撫視帝，內任保，而大柄悉以委居正。
居正為政，以尊主權、課吏職、信賞罰、一號令為主。雖萬里外，朝下而夕奉行。黔國公沐朝弼數犯法，當逮，朝議難之。居正擢用其子，馳使縛之，不敢動。既至，請貸其死，錮之南京。氵曹河通，居正以歲賦逾春，發水橫溢，非決則涸，乃采氵曹臣議，督艘卒以孟冬月兌運，及歲初畢發，少罹水患。行之久，太倉粟充盈，可支十年。互市饒馬，乃減太仆種馬，而令民以價納，太仆金亦積四百余萬。又為考成法以責吏治。初，部院覆奏行撫按勘者，嘗稽不報。居正令以大小緩急為限，誤者抵罪。自是，一切不敢飾非，政體為肅。南京小奄醉辱給事中，言者請究治。居正謫其尤激者趙參魯于外以悅保，而徐說保裁抑其黨，毋與六部事。其奉使者，時令緹騎陰诇之。其黨以是怨居正，而心不附保。